显微成像激光器是什么？

飞秒显微激光器可应用于各类先进非线性成像技术，包括多光子激发荧光显微、谐波产生以及拉曼成像。新一代显微激光光源具备波长可调谐、短脉宽、高重复频率与长期稳定输出等特性，能够满足严苛的成像需求。

采用 FLINT 飞秒振荡器采集经 H&E 染色大鼠皮肤的二次谐波（SHG）与三次谐波（THG）成像图。二次谐波信号（绿色）凸显胶原组织，三次谐波信号（青色）主要呈现苏木精染色的细胞核。图像尺寸约 600×600 µm，像素尺寸 0.5 µm/px，像素驻留时间约 14 µs/px，激光功率 20 mW。

图片由维尔纽斯大学物理学院先进生物医学光子学课题组提供。

显微激光器工作原理

多光子显微依赖可提供高光强的激光源，以此在生物组织内部产生非线性光学效应。与单光子激发不同，多光子激发是两个及以上低能量光子同时被荧光分子吸收，进而完成激发。该过程需要高光子数密度，将飞秒脉冲紧密聚焦即可高效实现。

由此，荧光激发几乎仅发生在显微物镜焦点处，无需共聚焦针孔即可实现天然光学层析效果。这种局域化激发能大幅降低离焦荧光信号，减少成像平面外的光漂白与光损伤。

显微成像常用激光器类型

不同显微成像场景，需搭配适配成像条件、荧光探针及穿透深度的专用激光器。

双光子显微激光器

双光子显微激光器通常兼具高重复频率、飞秒脉冲与近红外波段波长可调谐三大特点。数十 MHz 的重复频率可在快速扫描时高效生成荧光信号，约 100 fs 的脉冲能产生非线性激发所需的峰值光强。调谐输出覆盖 700–1300 nm 波段，可激发神经成像、功能成像、发育生物学中广泛使用的各类荧光蛋白、钙指示剂及其他荧光探针。

采用搭载红外光参量放大器（I-OPA）的 CARBIDE 飞秒激光器，对成年小鼠心房开展双光子光片成像。

本图由 Bliq Photonics 公司提供。

三光子显微激光器

相较于双光子系统，三光子显微激光器单脉冲能量更高，以实现高效高阶非线性激发。常用激发波长 1300 nm、1700 nm 恰好对应生物组织透明窗口，组织散射损耗更低，可在高散射生物样本中实现更深层成像。三光子激发的空间约束效果更强，能抑制离焦背景荧光，在近 1 mm 甚至更深的成像深度下仍保持良好图像对比度。为获得充足成像信号，三光子成像普遍采用约 50 fs 脉冲、μJ 级单脉冲能量、MHz 级重复频率的激光光源。

采用 CRONUS-3P 激光器，在 1300 nm 激发波长下对活体斑马鱼进行多模态三维成像。

三光子荧光（3PEF）—— 绿色；透射式二次谐波（trans SHG）—— 黄色；

反射式三次谐波（epi THG）—— 深蓝色；透射式三次谐波（trans THG）—— 青色。

图像由日内瓦大学 Luigi Bonacina 课题组提供。

可调谐飞秒激光器

显微专用可调谐激光器为现代多光子成像提供波长适配自由度。通过将激发波长与荧光蛋白、钙指示剂及光敏感蛋白的吸收特性相匹配，可调谐激光光源可提升激发效率，同时减少样品中不必要的能量沉积。波长可调特性同时兼容多种多模态成像手段：二次 / 三次谐波成像（SHG/THG）、相干 anti-Stokes 拉曼散射（CARS）、受激拉曼散射（SRS）。

采用 CRONUS-2P 设备采集流动聚苯乙烯（PS）与聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微球的 CARS 图像。下方系列图像为选定区域的时序成像，采样间隔 1 秒，用以直观展示微球流动过程；白色虚线作为运动参照基准。

DOI: 10.1002/jrs.6671

高重复频率激光器

高重复频率显微激光器多用于高速扫描、信号稳定输出的实验场景。重复频率从几 MHz 至数十 MHz，单次成像周期内可完成大量激发过程，荧光生成效率更高，信噪比更优。

显微激光器应用领域

显微激光光源广泛用于各类生命科学与生物医学研究：功能性神经成像、光遗传学、发育生物学、深层组织成像。依托多光子荧光显微、拉曼显微、谐波生成等先进成像技术，可在高空间分辨率、具备光学层析能力的前提下，获取生物样品的结构、功能与化学组分信息。

利用 PHAROS 飞秒激光器对小鼠嗅球神经元开展全息双光子光遗传刺激。

图像由纽约大学 Shy Shoham 课题组与 Dmitry Rinberg 课题组提供。

DOI: 10.1016/j.neuron.2020.07.034

飞秒激光器用于显微成像的优势

采用飞秒脉冲可在更低平均功率下高效产生信号，而长脉冲则需要更高的平均功率才能实现同等效果。这一点对生物样品至关重要：过高平均功率会造成组织升温，引发光损伤。深层成像场景下，脉宽的影响更为关键 —— 高阶非线性效应高度依赖峰值光强。以三光子显微为例，通常需要约 50 fs 脉冲，才能在深层组织中达到理想激发效率。

脉冲间能量稳定性同样关键。多光子显微中，脉冲能量波动会直接改变荧光信号强度，在图像中形成噪点或明暗不均。因此高能量稳定性是定量检测、长时间成像、高速采集实验的必备条件。

此外，新一代显微飞秒激光器支持波长调谐，可针对不同荧光蛋白、基因编码指示剂、光敏感蛋白优化激发条件。可调激发光适配多种非线性成像模式，研究者可根据目标成像深度、生物透明窗口灵活选择最优波长。

高端机型还可实现激发脉冲时序精准调控。显微光学元件会对脉冲引入群速度色散（GDD），先进激光系统内置色散补偿模块，保证到达样品处的脉冲维持最短脉宽，保障峰值光强。

搭载自适应光学的三光子显微镜可实现焦点探测与光束整形，同步校正像差与光散射带来的成像畸变。采用 ORPHEUS-F 激光器 1300 nm 波长激发，可在完整脑组织中穿透软脑膜下最深 1.1 mm 处完成成像。

图像由香港科技大学 Jianan Y. Qu 课题组提供。

双光子显微与三光子显微的区别

双光子、三光子显微均属于非线性成像，依靠多光子同步吸收产生荧光；二者虽都可实现光学层析与深层组织成像，但在激发波长、激光参数、成像深度上存在明显差异。

双光子显微常用 700–1300 nm 激发光，搭配数十 MHz 高重频飞秒激光器。该技术可高效激发绝大多数荧光探针，扫描速度快，在生物组织中成像深度可达数百 mm。但随着成像深度增加，沿光路产生的离焦荧光会持续降低图像对比度，最终限制最大穿透深度。

三光子显微采用更长波长（主流 1300 nm、1700 nm），对应组织散射更低的生物透明窗口。三光子属于更高阶非线性效应，荧光信号仅高度集中在焦点体积内，可大幅压制焦平面外背景噪声。因此在双光子成像对比度严重衰减的深层区域，三光子仍能维持清晰成像。

高效三光子激发一般需要约 50 fs 脉冲、更高单脉冲能量、MHz 级重复频率。该参数组合既能为深层成像提供充足峰值光强，又能将平均功率控制在生物样本可耐受范围内。

目前三光子显微已成为深层神经成像等领域的主流方案，适用于需在高散射组织中实现 1 mm 及以上深度观测的实验。

在 Thorlabs Bergamo II 型显微镜上，分别采用常规双光子激光器（920 nm）与 CRONUS-3P 三光子激光器（1300 nm），对小鼠视觉皮层表达 GCaMP 探针的神经元开展在体双光子、三光子钙成像对比实验。

图片由 CSHL ISFNS 2024 组委会、Willis Broden Jr. 以及 Sergey Matveev（Thorlabs）提供。