流式细胞术是生物医学科学中一项的基础技术，这个技术是使用激光来激发附着于细胞的分子荧光标记，并用光电倍增管（PMT）和其他光感测技术对其探测（见图一），将细胞以流体动力聚集的液体流的方式引入激光束。


图一。解析图显示基本流体细胞术的运作方式，通过流体动力聚焦，将细胞通过管口或封闭石英流动池引入液体流中的激光束。采集信号的光学元件负责采集被激发的荧光信号，然后这些信号会通过分色镜和窄带通滤波器导入光电倍增管。现代的仪器可以把光纤用于激光传输和信号收集。

一些流体细胞仪只能分析那些附在细胞表面或者在细胞内部的荧光标记。 在荧光 一 激活细胞分类器中（FACS），液体流分裂成液滴然后液滴产生静电荷然后转移到收集管里。细胞分选使基于荧光标记的细胞能分离和被收集，能使被收集的细胞可以用于功能研究和蛋白质组学和基因组分析。

激光应用在流式细胞术的背景

流式细胞术依靠激光技术来激发荧光标记是毫无疑问的1，最早的流体细胞仪采用单束激光器（当时通常为大型水冷离子激光器）来激发最多一到两个荧光探针，其中包括像荧光黄和若丹明的荧光素。当下的流体细胞仪采用波长从紫外线（大约355nm）到长红外线（大约700nm）横跨整个可见光谱的固体激光器。

高级流式细胞仪可以装备多大十个不同的单波长激光器，使很多种类的有着不同激发/发射特性的荧光探针能够被激发。早期的仪器只能激发和探测一到两个探针，而现在在高端的仪器上，同时侦测三十个甚至更多的荧光探针都已经成为可能，这个高维分析已经把我们对免疫系统的认知扩大到了前所未有的程度。

当前的流式细胞仪用许多激光波长和相对应的荧光探针对二十个或以上的细胞特征进行同步分析，这些先进的仪器通常会装备一个氰激光器（488nm）、一个红激光二极管（约640nm）、和一个绿、绿黄、或黄色二极管泵浦固体激光器（532/552/561nm），这些激光器都可以激发多种荧光素（见图二）。


图二：一个在流式细胞术中与能达到激发要求的激光波长配对的荧光探针的样本。这些探针绝大多数都在光谱上兼容而且可以同时与足够多的激光波长使用在仪器上。（BB：亮蓝、BYG：亮黄绿、BV：亮紫、和BUV:亮紫外线染料是BD Sirigen的注册商标，而Pacific Blue，Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 790是Thermo Fisher公司的注册商标。）

随着BD Sirigen的亮紫（BV）聚合物染料的发展，紫色激光二极管成为了重要的激发手段2。可以使用七种BV染料（BV421，BV480，BV570，BV605，BV650和BV787）进行光谱兼容、显着增加可分析的同步细胞标记的数量。紫外线（UV）激光器在流式细胞仪中已经越来越重要，最近开发的六种亮光紫外线染料（BUV395，VUV496，BUV563，BUV661，BUV737和BUV805），将同步荧光分析的总数接近30。目前，紫外激光已经成为了高级流式细胞术仪器使用中的一个关键部分。

当前的流式细胞仪主要依靠三倍频率掺杂钕的钒酸盐（Nd：YVO4）355 nm固体激光器来激发BUV和其他紫外线激发染料，这些激光器相对于以前需要提供UV激发的氩离子和氪离子激光器而言是相当大的进步，因为它们体积更小并且更容易维护。然而，这些激光器还是很昂贵的，而且是高端仪器中成本最高的单个部件。

许多UV激发染料（包括BUV）可以代替355纳米的较低成本的近紫外激光二极管（375nm）3。 然而，它们的波长非常接近BUV395的发射范围，这是系列中最短的，使其难以检测。 因此，需要相对便宜的固态紫外激光来降低高维流式细胞仪的成本。

简洁型320 nm激光模组

但是随着近来在由LASOS（德国）开发的在小型风冷组件中连续波（CW）发射的小型固体320nm激光模组的发展，情况已经改变了。流式细胞仪在过去曾被装备过氦镉激光器，利用其325nm的激光线来激发紫外染料。 然而，氦镉激光器不仅体积庞大，而且功率还不够，另外时间长了还会产生噪声。320nm光源的波长与传统的325nm波长非常接近，并且从激发光谱的角度来看，应该能相当不错地激发BUV染料。

为了测试不论激光波长或光源是否适合应用在流式细胞术上，一个320nm激光模组代替传统325nm紫外激光安装在了一个BD LSR II流式细胞仪上（见图三）4，然后将激光对准用于将细胞注入激光路径的液体流。最初配置为355 nm激光源的仪器的光学元件保持有效范围低至320 nm，宽带UV镜用于将激光转向样本流和熔融石英透镜以聚焦光束。

图3. LASOS 320 nm激光模组非常简介（a）。 用20mW的320（最高）或355nm（最低）激光源分析InSpeck Blue（b）微球混合物（7个群体）。 以20mW的320（最高）或355nm（最低）激光源分析用BUV563或BUV661标记的小鼠脾细胞（c和d）。 彩色痕迹表示标记的细胞，而灰色迹线表示未标记的对照。 用于InSpeck Blue微球BUV463和BUV661标记细胞的带通滤光片的光谱曲线显示在直方图下。 （图片由William Telford提供）

流式细胞术使用荧光染料标记的聚合物微球作为模拟样本，以确定仪器操作是否最佳，并测试新的激光源。 还分析了明亮和暗淡的紫外线激发微球（InSpeck Blue microspheres; Thermo Fisher，Eugene，OR）的混合物 - 最暗淡的群体的分辨率是良好的激发和检测的指标。 这些微球，包括最小的群体，可以很容易地用图3b激光源解决。 灵敏度与相同功率水平的355nm激光器相似。 然后使用与BUV563和BUV661（两种BUV染料）偶联的抗体将小鼠脾细胞标记为细胞表面标志物。 320nm模组激发这些样品几乎与355nm的激光源效果一样（参见图3c和3d）。 

因此，这证明了LASOS 320nm激光源能在流式细胞术中良好地替代355nm激光源激发。 这些激光模组比大多数355 nm光源更小，成本更低，使其成为高维流式细胞术有效的低成本替代品。 在这个范围内和整个可见光谱范围内的小型固态激光源已经彻底改变了流式细胞术，降低了现代仪器对尺寸，成本和维护的需求。 这是科技发展中一个令人鼓舞的趋势，并将继续为更好的生物医学分析仪器做出贡献。

1. W. G. Telford, Methods Cell Biol., 102, 375–410 (2011); doi:10.1016/b978-0-12-374912-3.00015-8.

2. P. K. Chattopadhyay et al., Cytometry A, 81, 456–466 (2012).

3. W. G. Telford, Cytometry A, 87, 1127–1137 (2015).

4. W. G. Telford, L. Strickland, and M. Koschorreck, Cytometry A, 91, 314–325 (2017).


翻译/Nick
文章来源：LaserFocusWorld