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深度解读

MMI激光显微切割系统捕获共生有化学细菌的海绵细胞

来源:基因有限公司2020-05-14 我要评论(0 )   

今天要和大家分享的主题是由普林斯顿大学分子生物学系Tianero, M.D.等研究人员发表在Nature Microbiology的“Localized production of defence chemicals by intracellu...

今天要和大家分享的主题是由普林斯顿大学分子生物学系Tianero, M.D.等研究人员发表在Nature Microbiology的“Localized production of defence chemicals by intracellular symbionts of Haliclona sponges”文章。作者通过MMI CellCut PLus激光显微切割技术、二代测序技术、流式分选技术及FISH技术等做了一个有趣的研究,在含有renieramycin生物碱的海绵Haliclona sp.中发现能产生renieramycin生物碱的共生菌Candidatus Endohaliclona renieramycinifaciens(Ca. E. renieramycinifaciens)。值得注意的是,共生菌Ca. E. renieramycinifaciens已经经历了极端的基因组减少,它几乎失去了自由生活所需的所有元素,同时保持了一个复杂的、质粒编码的多拷贝renieramycin生物碱生物合成基因簇。共生菌Ca. E. renieramycinifaciens存在于海绵以前未经鉴定的细胞库(化学细菌细胞)中,它产生的renieramycin生物碱为宿主提供一种抵御捕食和微生物感染的化学防御手段。这种共生关系在Haliclona海绵的一个分支中具有高度的特异性。
 
海洋海绵是微生物多样性最丰富的后生动物宿主之一。它们被认为是最原始的生物,是研究微生物与宿主相互作用的良好模型系统。海绵中的共生菌会产生许多具有不同生物活性的复杂代谢产物,其中包括未被充分研究的海绵代谢产物renieramycin生物碱。迄今为止,已经发现了约30种renieramycin生物碱,它们发挥了广泛的抗微生物和细胞毒性活性,这些活性在生态和治疗上都具有重要意义。从生物合成的角度来看,对renieramycin生物碱的了解还很少。renieramycin生物碱核心结构类似于四氢呋喃类的黄霉素,由于其组分较为广泛,引发了作者的研究兴趣,想确定最原始的后生动物:海洋海绵中的renieramycin生物碱生产的来源和分子基础。

首先,作者收集了四种来自不同太平洋地区不同年份和地理位置的含renieramycin生物碱的Haliclona海绵样品:Ren-Pal-02(帕劳,2002年),Ren-PNG-07060,RenPNG-07113(巴布亚新几内亚,2007)和Ren-Bali-16-03(巴厘岛,2016)。通过高效液相色谱结合高分辨率串联质谱(HPLC-HR-MS / MS)和核磁共振(NMR)化学分析验证了这些海绵中确实存在renieramycin生物碱。然后通过18S rRNA测序,确定了4种海绵具有较高的同源性(99.9%)。随后通过对4种海绵进行宏基因组测序分析,发现在海绵微生物中存在renieramycin生物碱生物合成基因簇(BGC),并进一步通过验证了ren(renieramycin生物碱生物合成基因簇,renieramycin BGCs)参与renieramycin的生物合成。

在发现了具有明显细菌起源的ren之后,作者试图进一步找出其基因组中含有ren的微生物组的成员,且该成员负责renieramycin生物碱的生产。通过对宏基因组的分析,发现ren存在于所有四个样品基因组中的一个小的细菌质粒上:p-ren。通过对宏基因组的分析发现有一个细菌染色体在序列保守性水平、覆盖率和GC含量上与p-ren相似,并把这种细菌命名为Ca. E. renieramycinifaciens。通过流式分选海绵匀浆的细胞,将细胞分类为不同大小的细胞(P3-P10),分别提取DNA进行16s rRNA测序,并对P4和P7到P10进行宏基因组测序。对测序结果进行分析发现Ca. E. renieramycinifaciens和p-ren主要富集在比较大颗粒的细胞中,且在五个分区的基因组中,Ca. E. renieramycinifaciens染色体和p-ren呈强正相关。进一步通过荧光原位杂交(FISH)和显微镜成像证明了Ca. E. renieramycinifaciens是一种细胞内共生体,仅存在于大型海绵细菌细胞(sponge bacteriocyte)中。



尽管流式细胞术、细胞分类和宏基因组结合分析为p-ren与Ca. E. renieramycinifaciens染色体的共域化提供了有力的支持,并且从显微镜下发现Ca. E. renieramycinifaciens存在于特殊的海绵细菌细胞中,但还不足以说明Ca. E. renieramycinifaciens中带有p-ren。因此作者试图进行最后一个实验,确定p-ren到Ca. E. renieramycinifaciens的位置。


借助易于识别的大海绵细菌细胞的球形形状,使用MMI CellCut PLus激光捕获显微切割(LCM)从稀释的Ren-Bali-16-03海绵匀浆中分离出100个此类单细胞。然后,从捕获的细胞中提取并测序了DNA,并与从捕获的背景膜中分离出的DNA作为对照进行了比较,分析了它们的宏基因组。结果明确表明Ca. E. renieramycinifaciens带有p-ren,并将renieramycin生物碱的产生进一步局限在海绵状细菌细胞中。因此,作者提出术语“化学细菌细胞”来描述海绵细胞,在该海绵细胞中,细胞内细菌共生体会产生化学防御分子。

最后,作者还根据16S rRNA基因及宏基因组数据的分析,证明了Ca. E. renieramycinifaciens基因组极度减少,为不能自由生活的专性长期共生体。利用高通量16S rRNA基因测序数据和18S rRNA基因序列构建的宿主海绵的系统树比较了不同的海绵,证实了Ca. E. renieramycinifaciens是一种特异性的海生海绵分支的细胞内共生体,在那里它控制着生物群落,专门生产renieramycin生物碱。


通过作者的研究,可以深刻了解到海绵将重要的结构和防御作用外包给了在其化学细菌细胞内共生的特殊化学细菌Ca. E. renieramycinifaciens。这个例子发生在最古老的后生动物身上,代表了微生物与宿主相互作用的祖先观点,并强调了在海绵体中发现更多细胞内共生体的重要性。


参考文献
Tianero, M.D., Balaich, J.N. & Donia, M.S. Localized production of defence chemicals by intracellular symbionts of Haliclona sponges. Nat Microbiol 4, 1149–1159 (2019). https://doi.org/10.1038/s41564-019-0415-8

德国Molecular Machine & Industries (MMI)是专门致力于将显微操作技术与高精度激光技术相结合应用于生命科学领域的一家专业公司,其标志性产品MMI CellCut激光显微切割系统和CellEctor单细胞分选系统成为目前世界上性能最优异的样本处理系统。基因有限公司作为MMI产品中国区合作伙伴,可为感兴趣的客户提供专业的产品咨询、技术答疑及联系试用等,欢迎大家前来咨询。


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激光显微切割系统基因组

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